- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Nuclear Transfer and ActivationAll
Nuclear Transfer and Activation
All micromanipulations are carried out in Hepes buffered
media. In our laboratory we use a SOF Hepes-based formulation
(Gardner et al., 1994) supplemented with 6 mg/ml of
BSA and/or 10% FCS for zona-free work. The zona pellucida
of in vitro matured oocytes is very thick and heterogeneous,
and due to hardening it is difficult to penetrate with a
bevelled standard pipette such as those used for enucleating
in vitro matured oocytes of other species. As a result, the
zona-enclosed conventional method for enucleation is more
difficult and less efficient. Moreover, the transfer of the
donor cell into the perivitelline space results in poor contact
between the oocyte and somatic cell membranes, thus
reducing the chance of successful electrofusion (Lagutina
et al., 2005; Li et al., 2002) even at high voltage. Further,
the presence of the zona pellucida acts as an electrical
shield that requires an increase in the voltage of fusion to
2–2.5 kV/cm, and this high voltage reduces subsequent
cleavage of the reconstructed embryos. Therefore, two
methods have been used to overcome this problem: the use
of piezo-electric manipulation (Kimura and Yanagimachi
1995), or pronase removal (the zona-free method) (Oback
et al., 2003). The piezo-driven micropipette is used to
penetrate the zona, to remove the first polar body and the
surrounding cytoplasm containing the metaphase plate
(visualized by Hoechst stain and UV light, in presence of
cytocalasin B), and also to microinject a somatic cell with
a broken cell membrane (Choi et al., 2002b) to obtain the
transfer of the donor nucleus into the enucleated oocyte.
For the zona-free method, the zona pellucida is
digested with 0.5% pronase in PBS. Zona-free oocytes
are enucleated under UV light with a blunt micropipette.
Subsequently, zona-free cytoplasts are individually washed
for a few seconds in 300 μg/ml phytohemagglutinin P in
PBS and then quickly dropped over a single donor cell
(Vajta et al., 2003) settled at the bottom of a drop of SOF–
Hepes. Formed cell couplets are washed in 0.3 M mannitol
(50 μM Ca and 100 μM Mg) solution and fused once
or twice at 15- to 30-minute intervals by two DC pulses
of 1.2 KV/cm applied for 30 μs at 26–27 h after the beginning
of maturation. With such an approach the fusion rate
approximates 100% and, because of the lower electric field
required, the rates of cleavage and of post-cleavage development
to the blastocyst stage are higher (Lagutina et al.,
2005, 2007).
Activation is usually performed 2–4 h after fusion. In
our experience horse oocytes are difficult to activate, and
the standard protocols used in ruminants do not yield a
high rate of cleavage. In our laboratory, we found that the
use of 5 μM ionomycin (a calcium ionophore) followed by
the synergistic effect of 6-DMAP (1 mM) and cycloheximide
(5 μg/ml) resulted in over 90% parthenogenetic
activation (Galli et al., 2007; Lazzari et al., 2002) and
cleavage of cloned embryos (Lagutina et al., 2005). Woods
et al. (2003) increased the calcium level during activation
of in vivo matured oocytes. Hinrichs et al. (2006,
2007) compared different activation treatments, including
the injection of sperm extract, which, in combination
with ionomycin, while not statistically different, provided
the highest blastocyst development rate and development
to term. However injection of murine PLC zeta cRNA
TABLE 22.5 Development of Horse NT Embryos Obtained with Adult Fibroblast Cells Treated with Trichostatin A
Horse TSA Treatment No. of Embryos Cleaved No. (%) MCD5 No. (%) MCD6 No. (%) BLD7 No. (%) BLD8 No. (%)
C Control 56 52 (92.9) 15 (26.8) 18 (32.1) 23 (41.1) 24 (42.9)
TSA 69 66 (95.7) 16 (23.2) 23 (33.3) 29 (42) 30 (43.5)
D Control 79 66 (83.5) 6 (7.6) 10 (12.7) 10 (12.7) 10 (12.7)
TSA 92 84 (91.3) 5 (5.4) 12 (13) 13 (14.1) 12 (13)
Number of replicates >> 4. No statistical difference between control and TSA treatment. Chi square test, P
All micromanipulations are carried out in Hepes buffered
media. In our laboratory we use a SOF Hepes-based formulation
(Gardner et al., 1994) supplemented with 6 mg/ml of
BSA and/or 10% FCS for zona-free work. The zona pellucida
of in vitro matured oocytes is very thick and heterogeneous,
and due to hardening it is difficult to penetrate with a
bevelled standard pipette such as those used for enucleating
in vitro matured oocytes of other species. As a result, the
zona-enclosed conventional method for enucleation is more
difficult and less efficient. Moreover, the transfer of the
donor cell into the perivitelline space results in poor contact
between the oocyte and somatic cell membranes, thus
reducing the chance of successful electrofusion (Lagutina
et al., 2005; Li et al., 2002) even at high voltage. Further,
the presence of the zona pellucida acts as an electrical
shield that requires an increase in the voltage of fusion to
2–2.5 kV/cm, and this high voltage reduces subsequent
cleavage of the reconstructed embryos. Therefore, two
methods have been used to overcome this problem: the use
of piezo-electric manipulation (Kimura and Yanagimachi
1995), or pronase removal (the zona-free method) (Oback
et al., 2003). The piezo-driven micropipette is used to
penetrate the zona, to remove the first polar body and the
surrounding cytoplasm containing the metaphase plate
(visualized by Hoechst stain and UV light, in presence of
cytocalasin B), and also to microinject a somatic cell with
a broken cell membrane (Choi et al., 2002b) to obtain the
transfer of the donor nucleus into the enucleated oocyte.
For the zona-free method, the zona pellucida is
digested with 0.5% pronase in PBS. Zona-free oocytes
are enucleated under UV light with a blunt micropipette.
Subsequently, zona-free cytoplasts are individually washed
for a few seconds in 300 μg/ml phytohemagglutinin P in
PBS and then quickly dropped over a single donor cell
(Vajta et al., 2003) settled at the bottom of a drop of SOF–
Hepes. Formed cell couplets are washed in 0.3 M mannitol
(50 μM Ca and 100 μM Mg) solution and fused once
or twice at 15- to 30-minute intervals by two DC pulses
of 1.2 KV/cm applied for 30 μs at 26–27 h after the beginning
of maturation. With such an approach the fusion rate
approximates 100% and, because of the lower electric field
required, the rates of cleavage and of post-cleavage development
to the blastocyst stage are higher (Lagutina et al.,
2005, 2007).
Activation is usually performed 2–4 h after fusion. In
our experience horse oocytes are difficult to activate, and
the standard protocols used in ruminants do not yield a
high rate of cleavage. In our laboratory, we found that the
use of 5 μM ionomycin (a calcium ionophore) followed by
the synergistic effect of 6-DMAP (1 mM) and cycloheximide
(5 μg/ml) resulted in over 90% parthenogenetic
activation (Galli et al., 2007; Lazzari et al., 2002) and
cleavage of cloned embryos (Lagutina et al., 2005). Woods
et al. (2003) increased the calcium level during activation
of in vivo matured oocytes. Hinrichs et al. (2006,
2007) compared different activation treatments, including
the injection of sperm extract, which, in combination
with ionomycin, while not statistically different, provided
the highest blastocyst development rate and development
to term. However injection of murine PLC zeta cRNA
TABLE 22.5 Development of Horse NT Embryos Obtained with Adult Fibroblast Cells Treated with Trichostatin A
Horse TSA Treatment No. of Embryos Cleaved No. (%) MCD5 No. (%) MCD6 No. (%) BLD7 No. (%) BLD8 No. (%)
C Control 56 52 (92.9) 15 (26.8) 18 (32.1) 23 (41.1) 24 (42.9)
TSA 69 66 (95.7) 16 (23.2) 23 (33.3) 29 (42) 30 (43.5)
D Control 79 66 (83.5) 6 (7.6) 10 (12.7) 10 (12.7) 10 (12.7)
TSA 92 84 (91.3) 5 (5.4) 12 (13) 13 (14.1) 12 (13)
Number of replicates >> 4. No statistical difference between control and TSA treatment. Chi square test, P
0/5000
โอนนิวเคลียร์และเปิดใช้งานMicromanipulations ทั้งหมดจะดำเนินการใน Hepes bufferedสื่อ ในห้องปฏิบัติการของเรา ที่เราใช้กำหนดที่ใช้ SOF Hepes(การ์ดเนอร์ et al., 1994) เสริม ด้วย 6 mg/ml ของบีเอสเอและ/หรือ 10% FCS สำหรับงานฟรีอสุจิ Pellucida อสุจิของการเพาะเลี้ยง matured แช่สารละลายจะหนา และแตกต่าง กันและเนื่องจากแข็ง เป็นยากเข้ากับการเปตต์ bevelled มาตรฐานเช่นใช้สำหรับ enucleatingการเพาะเลี้ยง matured แช่สารละลายชนิดอื่น ๆ ดังนั้น การอสุจิอยู่วิธีธรรมดาสำหรับ enucleation คือเพิ่มเติมยาก และมีประสิทธิภาพน้อย นอกจากนี้ การโอนย้ายการผู้บริจาคเซลล์เป็นผลพื้นที่ perivitelline ติดต่อยากระหว่าง oocyte และ somatic เซลล์เยื่อหุ้ม ดังนั้นลดโอกาสของความสำเร็จ electrofusion (Lagutinaร้อยเอ็ด al., 2005 Li et al., 2002) ได้ที่แรงดันสูง เพิ่มเติมของ pellucida อสุจิทำหน้าที่เป็นการไฟฟ้าโล่ที่ต้องการเพิ่มแรงดันของการหลอมเหลวเพื่อ2 – 2.5 kV/cm และแรงดันสูงนี้ลดตามมาปริของโคลนสร้างขึ้นใหม่ ดังนั้น ทั้งสองการใช้วิธีการเอาชนะปัญหานี้: การใช้ของ piezo ไฟฟ้าจัดการ (คิมุระโยและ Yanagimachi1995), หรือเอา pronase (อสุจิ-ฟรีวิธี) (Obackและ al., 2003) ใช้ micropipette ควบคุม piezoบุกอสุจิ การเอาขั้วโลกตัวแรกและล้อมรอบไซโทพลาซึมประกอบด้วยจาน metaphase(visualized คราบอย่างไร Hoechst และ UV แสง ในของcytocalasin B), และยัง microinject มาติกเซลล์ด้วยการแตกเซลล์เมมเบรน (Choi et al., 2002b) เพื่อขอรับการโอนย้ายนิวเคลียสผู้บริจาคใน enucleated oocyteสำหรับวิธีการฟรีอสุจิ pellucida อสุจิคือต้อง มี pronase 0.5% ใน PBS แช่สารละลายโซนาฟรีมี enucleated ภายใต้แสง UV ด้วย micropipette ทื่อในเวลาต่อมา cytoplasts ฟรีอสุจิทีจะล้างสำหรับใน 300 μg/ml phytohemagglutinin P ในไม่กี่วินาทีPBS แล้ว อย่างรวดเร็วลดลงผ่านเซลล์เดียวบริจาค(Vajta et al., 2003) ชำระเงินที่ด้านล่างของหล่นของ SOF –Hepes เกิดเซลล์ couplets จะล้างใน mannitol 0.3 M(50 μM Ca และ 100 μM Mg) โซลูชันและหลอมครั้งหรือสองครั้งในช่วงเวลา 15 - ไป 30 นาทีโดย DC สองกะพริบ1.2 KV/cm ใช้สำหรับ μs 30 ที่ 26 – 27 h หลังจากจุดเริ่มต้นของของพ่อแม่ ด้วยเช่นวิธีการผสมผสานอัตราapproximates 100% และ เนื่อง จากสนามไฟฟ้าต่ำจำเป็น ราคา ของปริ และปริหลังพัฒนาอดีตการขั้นสูงขึ้น (Lagutina et al.,2005, 2007)เปิดใช้งานเป็น h 2-4 มักจะทำหลังจากฟิวชั่น ในแช่สารละลายม้าของเราประสบการณ์ยากต่อการเรียกใช้งาน และโพรโทคอลมาตรฐานที่ใช้ใน ruminants ผลผลิตไม่เป็นอัตราสูงของปริ ในห้องปฏิบัติการของเรา เราพบว่าการใช้ของ ionomycin μM 5 (แคลเซียม ionophore) ตามด้วยผลพลัง 6-DMAP (1 มิลลิเมตร) และ cycloheximide(5 μg/ml) ส่งผลให้ parthenogenetic กว่า 90%เปิดใช้งาน (Galli et al., 2007 Lazzari et al., 2002) และปริของโคลนโคลน (Lagutina et al., 2005) ป่าal. ร้อยเอ็ด (2003) เพิ่มระดับแคลเซียมในระหว่างการเปิดใช้งานในสัตว์ทดลองของ matured แช่สารละลาย Al. ร้อยเอ็ด Hinrichs (2006รักษาการเปิดใช้งานแตกต่างกันเปรียบเทียบ 2007) รวมทั้งการฉีดอสุจิแยก ซึ่ง ในชุดมี ionomycin ในขณะที่ไม่แตกต่างทางสถิติ ให้อัตราสูงสุดอดีตพัฒนาและพัฒนาในระยะนั้น อย่างไรก็ตามการฉีด murine PLC แคเธอรีนซีตา cRNA22.5 ตารางพัฒนา NT ม้าโคลนได้รับเซลล์ Fibroblast ผู้ใหญ่รับ Trichostatin Aม้า TSA รักษาหมายเลข ของโคลนแหวกจำนวน (%) MCD5 จำนวน (%) MCD6 จำนวน (%) BLD7 จำนวน (%) BLD8 จำนวน (%)C ควบคุม 56 52 (92.9) 15 (26.8) 18 (32.1) 23 (41.1) 24 (42.9)TSA 69 66 (95.7) 16 (23.2) 23 (33.3) 29 (42) 30 (43.5)ควบคุม D 79 66 (83.5) 6 (7.6) 10 (12.7) 10 (12.7) 10 (12.7)TSA 92 84 (91.3) 5 (5.4) 12 (13) 13 (14.1 สา) 12 (13)จำนวนเหมือนกับ >> 4 ไม่แตกต่างทางสถิติระหว่างตัวควบคุมและ TSA รักษา ชีตารางทดสอบ P < 0.05.MCD5, morula กระชับวัน 5 MCD6จำนวนรวมของ morula กระชับในวัน 6 BlD7, blastocysts วัน 7 BlD8 จำนวน blastocysts วัน 8
การแปล กรุณารอสักครู่..
Nuclear Transfer and Activation
All micromanipulations are carried out in Hepes buffered
media. In our laboratory we use a SOF Hepes-based formulation
(Gardner et al., 1994) supplemented with 6 mg/ml of
BSA and/or 10% FCS for zona-free work. The zona pellucida
of in vitro matured oocytes is very thick and heterogeneous,
and due to hardening it is difficult to penetrate with a
bevelled standard pipette such as those used for enucleating
in vitro matured oocytes of other species. As a result, the
zona-enclosed conventional method for enucleation is more
difficult and less efficient. Moreover, the transfer of the
donor cell into the perivitelline space results in poor contact
between the oocyte and somatic cell membranes, thus
reducing the chance of successful electrofusion (Lagutina
et al., 2005; Li et al., 2002) even at high voltage. Further,
the presence of the zona pellucida acts as an electrical
shield that requires an increase in the voltage of fusion to
2–2.5 kV/cm, and this high voltage reduces subsequent
cleavage of the reconstructed embryos. Therefore, two
methods have been used to overcome this problem: the use
of piezo-electric manipulation (Kimura and Yanagimachi
1995), or pronase removal (the zona-free method) (Oback
et al., 2003). The piezo-driven micropipette is used to
penetrate the zona, to remove the first polar body and the
surrounding cytoplasm containing the metaphase plate
(visualized by Hoechst stain and UV light, in presence of
cytocalasin B), and also to microinject a somatic cell with
a broken cell membrane (Choi et al., 2002b) to obtain the
transfer of the donor nucleus into the enucleated oocyte.
For the zona-free method, the zona pellucida is
digested with 0.5% pronase in PBS. Zona-free oocytes
are enucleated under UV light with a blunt micropipette.
Subsequently, zona-free cytoplasts are individually washed
for a few seconds in 300 μg/ml phytohemagglutinin P in
PBS and then quickly dropped over a single donor cell
(Vajta et al., 2003) settled at the bottom of a drop of SOF–
Hepes. Formed cell couplets are washed in 0.3 M mannitol
(50 μM Ca and 100 μM Mg) solution and fused once
or twice at 15- to 30-minute intervals by two DC pulses
of 1.2 KV/cm applied for 30 μs at 26–27 h after the beginning
of maturation. With such an approach the fusion rate
approximates 100% and, because of the lower electric field
required, the rates of cleavage and of post-cleavage development
to the blastocyst stage are higher (Lagutina et al.,
2005, 2007).
Activation is usually performed 2–4 h after fusion. In
our experience horse oocytes are difficult to activate, and
the standard protocols used in ruminants do not yield a
high rate of cleavage. In our laboratory, we found that the
use of 5 μM ionomycin (a calcium ionophore) followed by
the synergistic effect of 6-DMAP (1 mM) and cycloheximide
(5 μg/ml) resulted in over 90% parthenogenetic
activation (Galli et al., 2007; Lazzari et al., 2002) and
cleavage of cloned embryos (Lagutina et al., 2005). Woods
et al. (2003) increased the calcium level during activation
of in vivo matured oocytes. Hinrichs et al. (2006,
2007) compared different activation treatments, including
the injection of sperm extract, which, in combination
with ionomycin, while not statistically different, provided
the highest blastocyst development rate and development
to term. However injection of murine PLC zeta cRNA
TABLE 22.5 Development of Horse NT Embryos Obtained with Adult Fibroblast Cells Treated with Trichostatin A
Horse TSA Treatment No. of Embryos Cleaved No. (%) MCD5 No. (%) MCD6 No. (%) BLD7 No. (%) BLD8 No. (%)
C Control 56 52 (92.9) 15 (26.8) 18 (32.1) 23 (41.1) 24 (42.9)
TSA 69 66 (95.7) 16 (23.2) 23 (33.3) 29 (42) 30 (43.5)
D Control 79 66 (83.5) 6 (7.6) 10 (12.7) 10 (12.7) 10 (12.7)
TSA 92 84 (91.3) 5 (5.4) 12 (13) 13 (14.1) 12 (13)
Number of replicates >> 4. No statistical difference between control and TSA treatment. Chi square test, P<0.05.MCD5, compacted morula day 5; MCD6,
total number of compacted morula on day 6; BlD7, blastocysts on day 7; BlD8, total number of blastocysts on day 8.
All micromanipulations are carried out in Hepes buffered
media. In our laboratory we use a SOF Hepes-based formulation
(Gardner et al., 1994) supplemented with 6 mg/ml of
BSA and/or 10% FCS for zona-free work. The zona pellucida
of in vitro matured oocytes is very thick and heterogeneous,
and due to hardening it is difficult to penetrate with a
bevelled standard pipette such as those used for enucleating
in vitro matured oocytes of other species. As a result, the
zona-enclosed conventional method for enucleation is more
difficult and less efficient. Moreover, the transfer of the
donor cell into the perivitelline space results in poor contact
between the oocyte and somatic cell membranes, thus
reducing the chance of successful electrofusion (Lagutina
et al., 2005; Li et al., 2002) even at high voltage. Further,
the presence of the zona pellucida acts as an electrical
shield that requires an increase in the voltage of fusion to
2–2.5 kV/cm, and this high voltage reduces subsequent
cleavage of the reconstructed embryos. Therefore, two
methods have been used to overcome this problem: the use
of piezo-electric manipulation (Kimura and Yanagimachi
1995), or pronase removal (the zona-free method) (Oback
et al., 2003). The piezo-driven micropipette is used to
penetrate the zona, to remove the first polar body and the
surrounding cytoplasm containing the metaphase plate
(visualized by Hoechst stain and UV light, in presence of
cytocalasin B), and also to microinject a somatic cell with
a broken cell membrane (Choi et al., 2002b) to obtain the
transfer of the donor nucleus into the enucleated oocyte.
For the zona-free method, the zona pellucida is
digested with 0.5% pronase in PBS. Zona-free oocytes
are enucleated under UV light with a blunt micropipette.
Subsequently, zona-free cytoplasts are individually washed
for a few seconds in 300 μg/ml phytohemagglutinin P in
PBS and then quickly dropped over a single donor cell
(Vajta et al., 2003) settled at the bottom of a drop of SOF–
Hepes. Formed cell couplets are washed in 0.3 M mannitol
(50 μM Ca and 100 μM Mg) solution and fused once
or twice at 15- to 30-minute intervals by two DC pulses
of 1.2 KV/cm applied for 30 μs at 26–27 h after the beginning
of maturation. With such an approach the fusion rate
approximates 100% and, because of the lower electric field
required, the rates of cleavage and of post-cleavage development
to the blastocyst stage are higher (Lagutina et al.,
2005, 2007).
Activation is usually performed 2–4 h after fusion. In
our experience horse oocytes are difficult to activate, and
the standard protocols used in ruminants do not yield a
high rate of cleavage. In our laboratory, we found that the
use of 5 μM ionomycin (a calcium ionophore) followed by
the synergistic effect of 6-DMAP (1 mM) and cycloheximide
(5 μg/ml) resulted in over 90% parthenogenetic
activation (Galli et al., 2007; Lazzari et al., 2002) and
cleavage of cloned embryos (Lagutina et al., 2005). Woods
et al. (2003) increased the calcium level during activation
of in vivo matured oocytes. Hinrichs et al. (2006,
2007) compared different activation treatments, including
the injection of sperm extract, which, in combination
with ionomycin, while not statistically different, provided
the highest blastocyst development rate and development
to term. However injection of murine PLC zeta cRNA
TABLE 22.5 Development of Horse NT Embryos Obtained with Adult Fibroblast Cells Treated with Trichostatin A
Horse TSA Treatment No. of Embryos Cleaved No. (%) MCD5 No. (%) MCD6 No. (%) BLD7 No. (%) BLD8 No. (%)
C Control 56 52 (92.9) 15 (26.8) 18 (32.1) 23 (41.1) 24 (42.9)
TSA 69 66 (95.7) 16 (23.2) 23 (33.3) 29 (42) 30 (43.5)
D Control 79 66 (83.5) 6 (7.6) 10 (12.7) 10 (12.7) 10 (12.7)
TSA 92 84 (91.3) 5 (5.4) 12 (13) 13 (14.1) 12 (13)
Number of replicates >> 4. No statistical difference between control and TSA treatment. Chi square test, P<0.05.MCD5, compacted morula day 5; MCD6,
total number of compacted morula on day 6; BlD7, blastocysts on day 7; BlD8, total number of blastocysts on day 8.
การแปล กรุณารอสักครู่..
การโอนและการเปิดใช้งานทั้งหมดจะดำเนินการใน micromanipulations
สื่อฮีเปสในนิวเคลียร์ ในห้องปฏิบัติการของเราเราใช้ตัวอย่างการใช้ฮีเปส
( Gardner et al . , 1994 ) เสริมด้วย 6 มก. / มล.
BSA และ / หรือ 10% FCS เพื่อค้นหางานฟรี การค้นหา pellucida
ของการสุกตัวเป็นอย่างหนาและแข็งต่างกัน ,
และเนื่องจากมันเป็นเรื่องยากที่จะเจาะด้วย
คอลัมน์มาตรฐานเปต เช่นที่ใช้สำหรับ enucleating
การสุกตัวของสายพันธุ์อื่น ๆ ผล การค้นหาวิธีการเข้าสมาธิอยู่
เป็นมากขึ้นยากและมีประสิทธิภาพน้อยลง นอกจากนี้ การโอนของผู้บริจาคเซลล์ใน perivitelline
ผลในพื้นที่ติดต่อระหว่างเยื่อหุ้มเซลล์และยากจนผ่านทางกายจึง
ลดโอกาสของการประสบความสำเร็จ electrofusion ( lagutina
et al . , 2005 ; Li et al . , 2002 ) ที่แรงดันสูง ต่อไป
สถานะของโซนา pellucida ทำหน้าที่เป็นโล่ที่ใช้ไฟฟ้า
เพิ่มแรงดันของฟิวชั่น
2 – 2.5 kV / cm และแรงดันสูงนี้ช่วยลดความแตกแยกตามมา
ของการฟื้นฟูระยะก่อนการฝังตัว ดังนั้น สอง
วิธีมีการใช้เพื่อเอาชนะปัญหานี้ใช้ Piezo ไฟฟ้า ( คิมูระ
ของการจัดการ และ yanagimachi
1995 ) หรือโปรเนสเอา ( วิธีค้นหาฟรี ) ( oback
et al . , 2003 ) มี Piezo ขับเคลื่อนไมโครปิเปตใช้
เจาะโซนาเพื่อลบตัวแรกขั้วโลกและล้อมรอบไซโทพลาซึมที่มีองค์ประกอบจาน
( ภาพโดย Hoechst คราบ และแสงยูวี , ในการแสดงตนของ
cytocalasin B )และยัง microinject เซลล์โซมาติกกับ
เป็นเยื่อหุ้มเซลล์เสีย ( Choi et al . , 2002b ) เพื่อขอรับ
โอนของผู้บริจาคไข่ นิวเคลียสใน enucleated .
สำหรับค้นหาฟรีวิธีการ ค้นหา pellucida คือ
ย่อยด้วยโปรเนส 0.5% ใน PBS ค้นหาฟรีไข่
เป็น enucleated ภายใต้แสงยูวีด้วยไมโครปิเปตทื่อ
จำนวนโอโอไซต์ค้นหาแบบล้าง
ฟรีในไม่กี่วินาทีในμ 300 g / ml เกิด P ใน
PBS ได้อย่างรวดเร็วและจากนั้นลดลงมากกว่าผู้บริจาคเซลล์เดียว
( vajta et al . , 2003 ) ตัดสินที่ด้านล่างของหยดตัวอย่าง–
ฮีเปส . รูปแบบเซลล์ couplets จะล้างใน 0.3 M mannitol
( 50 μ M CA และ 100 μ M มก. ) สารละลายผสมครั้งเดียวหรือสองครั้ง
15 - 30 นาที โดยช่วง 2 DC พัลส์
12 kV / cm ใช้ 30 μ S ที่ 26 – 27 ชั่วโมงหลังจากจุดเริ่มต้น
ของวุฒิภาวะ ด้วยวิธีการเช่นนี้อัตราการเชื่อม
ประมาณ 100% และ เพราะลดสนามไฟฟ้า
ที่ต้องการอัตราการของการพัฒนาและการโพสต์ไปยังตัวอ่อนระยะที่สูงขึ้น (
lagutina et al . , 2005 , 2007 ) .
เปิดใช้งานปกติจะแสดง 2 – 4 ชั่วโมงหลังจากการรวมตัว ใน
ไข่ม้าประสบการณ์ของเราจะยากที่จะเปิดใช้งาน และมาตรฐานโปรโตคอลที่ใช้ในสัตว์เคี้ยวเอื้อง
ไม่ได้ให้ผลตอบแทนในอัตราสูงของความแตกแยก ในห้องปฏิบัติการของเรา เราจะพบว่า การใช้ ionomycin
5 M μ ( แคลเซียมไอโอโนฟอร์ ) ตามด้วย
ผลที่ 6-dmap ( 1 มิลลิเมตร ) และร้อยเรียง
( 5 μ g / ml ) ( กว่า 90% parthenogenetic
กระตุ้น ( แกลลิ et al . , 2007 ; ลัตซารี่ et al . , 2002
) และความแตกแยกของโคลนตัวอ่อน ( lagutina et al . , 2005 ) ป่า
et al . ( 2003 ) เพิ่มระดับแคลเซียมในการกระตุ้นในร่างกายผู้ใหญ่
ของไข่ . Hinrichs et al . ( 2006 ,
2007 ) เมื่อเทียบการรักษากระตุ้นต่าง ๆรวมทั้ง
ฉีดอสุจิสกัด ซึ่งในการรวมกัน
กับ ionomycin ในขณะที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยอัตราสูงสุดและการพัฒนา
ตัวอ่อนพัฒนาระยะ . อย่างไรก็ตามการฉีดโต๊ะ ~ ( ซีตา crna
22.5 พัฒนาของตัวอ่อนได้ม้า NT กับผู้ใหญ่ที่ได้รับการรักษาด้วยเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันไตรโค ตติน เอ
ม้ารักษาไม่เจริญของ TSA ของข้อ ( % ) mcd5 ไม่ ( % ) mcd6 ไม่ ( % ) bld7 ไม่ ( % ) bld8 ไม่ ( % )
c ควบคุม 56 52 ( 92.9 ) 15 ( 26.8 ) 18 ( 32.1 ) 23 ( 41.1 ) 24 ( ผู้นำ )
TSA 69 66 ( ตลาด ) 16 ( 23.2 ) 23 ( 3 ) 29 ( 42 ) 30 ( 82% )
มควบคุม 79 66 ( แอ็ด ) 6 ( 7.6 ) 10 ( 12.7 ) 10 ( 12.7 ) 10 ( 12.7 )
TSA 92 84 ( เพิ่มขึ้น ) 5 ( 5.4 ) 12 ( 13 ) 13 ( 14.1 ) 12 ( 13 )
จํานวนซ้ำ > > 4 ไม่มีความแตกต่างระหว่างการควบคุม หรือการรักษา การทดสอบไคสแควร์ , p < 0.05.mcd5 กะบะมอรูลา 5 วัน mcd6
; , จํานวนอัดมอรูลาวันที่ 6 ; bld7 โต , วันที่ 7 bld8 , จำนวนรวมของบลาสโตซีสในวันที่ 8
สื่อฮีเปสในนิวเคลียร์ ในห้องปฏิบัติการของเราเราใช้ตัวอย่างการใช้ฮีเปส
( Gardner et al . , 1994 ) เสริมด้วย 6 มก. / มล.
BSA และ / หรือ 10% FCS เพื่อค้นหางานฟรี การค้นหา pellucida
ของการสุกตัวเป็นอย่างหนาและแข็งต่างกัน ,
และเนื่องจากมันเป็นเรื่องยากที่จะเจาะด้วย
คอลัมน์มาตรฐานเปต เช่นที่ใช้สำหรับ enucleating
การสุกตัวของสายพันธุ์อื่น ๆ ผล การค้นหาวิธีการเข้าสมาธิอยู่
เป็นมากขึ้นยากและมีประสิทธิภาพน้อยลง นอกจากนี้ การโอนของผู้บริจาคเซลล์ใน perivitelline
ผลในพื้นที่ติดต่อระหว่างเยื่อหุ้มเซลล์และยากจนผ่านทางกายจึง
ลดโอกาสของการประสบความสำเร็จ electrofusion ( lagutina
et al . , 2005 ; Li et al . , 2002 ) ที่แรงดันสูง ต่อไป
สถานะของโซนา pellucida ทำหน้าที่เป็นโล่ที่ใช้ไฟฟ้า
เพิ่มแรงดันของฟิวชั่น
2 – 2.5 kV / cm และแรงดันสูงนี้ช่วยลดความแตกแยกตามมา
ของการฟื้นฟูระยะก่อนการฝังตัว ดังนั้น สอง
วิธีมีการใช้เพื่อเอาชนะปัญหานี้ใช้ Piezo ไฟฟ้า ( คิมูระ
ของการจัดการ และ yanagimachi
1995 ) หรือโปรเนสเอา ( วิธีค้นหาฟรี ) ( oback
et al . , 2003 ) มี Piezo ขับเคลื่อนไมโครปิเปตใช้
เจาะโซนาเพื่อลบตัวแรกขั้วโลกและล้อมรอบไซโทพลาซึมที่มีองค์ประกอบจาน
( ภาพโดย Hoechst คราบ และแสงยูวี , ในการแสดงตนของ
cytocalasin B )และยัง microinject เซลล์โซมาติกกับ
เป็นเยื่อหุ้มเซลล์เสีย ( Choi et al . , 2002b ) เพื่อขอรับ
โอนของผู้บริจาคไข่ นิวเคลียสใน enucleated .
สำหรับค้นหาฟรีวิธีการ ค้นหา pellucida คือ
ย่อยด้วยโปรเนส 0.5% ใน PBS ค้นหาฟรีไข่
เป็น enucleated ภายใต้แสงยูวีด้วยไมโครปิเปตทื่อ
จำนวนโอโอไซต์ค้นหาแบบล้าง
ฟรีในไม่กี่วินาทีในμ 300 g / ml เกิด P ใน
PBS ได้อย่างรวดเร็วและจากนั้นลดลงมากกว่าผู้บริจาคเซลล์เดียว
( vajta et al . , 2003 ) ตัดสินที่ด้านล่างของหยดตัวอย่าง–
ฮีเปส . รูปแบบเซลล์ couplets จะล้างใน 0.3 M mannitol
( 50 μ M CA และ 100 μ M มก. ) สารละลายผสมครั้งเดียวหรือสองครั้ง
15 - 30 นาที โดยช่วง 2 DC พัลส์
12 kV / cm ใช้ 30 μ S ที่ 26 – 27 ชั่วโมงหลังจากจุดเริ่มต้น
ของวุฒิภาวะ ด้วยวิธีการเช่นนี้อัตราการเชื่อม
ประมาณ 100% และ เพราะลดสนามไฟฟ้า
ที่ต้องการอัตราการของการพัฒนาและการโพสต์ไปยังตัวอ่อนระยะที่สูงขึ้น (
lagutina et al . , 2005 , 2007 ) .
เปิดใช้งานปกติจะแสดง 2 – 4 ชั่วโมงหลังจากการรวมตัว ใน
ไข่ม้าประสบการณ์ของเราจะยากที่จะเปิดใช้งาน และมาตรฐานโปรโตคอลที่ใช้ในสัตว์เคี้ยวเอื้อง
ไม่ได้ให้ผลตอบแทนในอัตราสูงของความแตกแยก ในห้องปฏิบัติการของเรา เราจะพบว่า การใช้ ionomycin
5 M μ ( แคลเซียมไอโอโนฟอร์ ) ตามด้วย
ผลที่ 6-dmap ( 1 มิลลิเมตร ) และร้อยเรียง
( 5 μ g / ml ) ( กว่า 90% parthenogenetic
กระตุ้น ( แกลลิ et al . , 2007 ; ลัตซารี่ et al . , 2002
) และความแตกแยกของโคลนตัวอ่อน ( lagutina et al . , 2005 ) ป่า
et al . ( 2003 ) เพิ่มระดับแคลเซียมในการกระตุ้นในร่างกายผู้ใหญ่
ของไข่ . Hinrichs et al . ( 2006 ,
2007 ) เมื่อเทียบการรักษากระตุ้นต่าง ๆรวมทั้ง
ฉีดอสุจิสกัด ซึ่งในการรวมกัน
กับ ionomycin ในขณะที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยอัตราสูงสุดและการพัฒนา
ตัวอ่อนพัฒนาระยะ . อย่างไรก็ตามการฉีดโต๊ะ ~ ( ซีตา crna
22.5 พัฒนาของตัวอ่อนได้ม้า NT กับผู้ใหญ่ที่ได้รับการรักษาด้วยเซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันไตรโค ตติน เอ
ม้ารักษาไม่เจริญของ TSA ของข้อ ( % ) mcd5 ไม่ ( % ) mcd6 ไม่ ( % ) bld7 ไม่ ( % ) bld8 ไม่ ( % )
c ควบคุม 56 52 ( 92.9 ) 15 ( 26.8 ) 18 ( 32.1 ) 23 ( 41.1 ) 24 ( ผู้นำ )
TSA 69 66 ( ตลาด ) 16 ( 23.2 ) 23 ( 3 ) 29 ( 42 ) 30 ( 82% )
มควบคุม 79 66 ( แอ็ด ) 6 ( 7.6 ) 10 ( 12.7 ) 10 ( 12.7 ) 10 ( 12.7 )
TSA 92 84 ( เพิ่มขึ้น ) 5 ( 5.4 ) 12 ( 13 ) 13 ( 14.1 ) 12 ( 13 )
จํานวนซ้ำ > > 4 ไม่มีความแตกต่างระหว่างการควบคุม หรือการรักษา การทดสอบไคสแควร์ , p < 0.05.mcd5 กะบะมอรูลา 5 วัน mcd6
; , จํานวนอัดมอรูลาวันที่ 6 ; bld7 โต , วันที่ 7 bld8 , จำนวนรวมของบลาสโตซีสในวันที่ 8
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Establishing responsibility often requir
- valables un an
- I'll try to make this more.
- What time u get up
- Hi, I'm cold water Free time I like to l
- Most of these were in the north and the
- Hi, I'm cold water Free time I like to l
- ิิbien et toi?ca fait longtemps c'est vr
- Now, Chiang Mai is cold. You can go to D
- คุณคงจะเข้าที่ฉันพูด
- approval
- คุณปรึกษาเขาก่อนได้ไหม
- Single unlimeted
- local
- เมื่อลมพัดมาอย่างแรง
- the use of multiple thresholds resulting
- คุณไม่คิดจะเปลี่ยนโรงแรมหรอ
- Why are you chose me ?
- TEXTA number sign (#) is used with this
- love the way you lie
- which got no gum
- quakes
- The March 86C chassis driven by Bobby Ra
- Point-based operations on images
