glycolytic enzymes [17]. While the

glycolytic enzymes [17]. While the glycolytic enzyme pyruvate
kinase converts PEP into pyruvate during metabolism of other carbon
sources (17), a unique characteristic of glycerol metabolism
is that the conversion of PEP into pyruvate is coupled to DHA
phosphorylation (i.e., since DHAK uses PEP as the phosphate group
donor). This coupled reaction is a critical component of glycerol fermentation
in E. coli and generates a cycle in the metabolic pathway
(Fig. 1) which for the purpose of the model allows the assumption of
negligible pyruvate kinase activity. The biosynthesis of acetyl-CoA
from pyruvate can occur through two different enzymes, the pyruvate
dehydrogenase complex (PDHC) and pyruvate formatelyase
(PFL). However, considering the high NADH/NAD ratios observed
during glycerol fermentation [18] and given that NADH negatively
regulates PDHC [19], PFL is expected to play a primary role. The final
reactions in the biosynthetic pathway of bioethanol in E. coli consist
of the two-step conversion of acetyl-CoA into ethanol through the
actions of acetaldehyde/alcohol dehydrogenase (ALDH/ADH) [19].
For some time, it was thought that the metabolism of glycerol in
E. coli required the presence of external electron acceptors [20–23],
but recently, it was discovered that E. coli can metabolize glycerol
in a fermentative manner [16,18,24]. These researchers also
identified the environmental conditions that enable this metabolic
process, along with the pathways and mechanisms responsible for
it [16]. These studies also suggested the feasibility of fermentation
of glycerol into fuels, and other reduced chemicals, by inducing the
dormant, native 1,2-propanediol fermentative pathway in E. coli
without using external electron acceptors [18,24]. However, this
approach, faces several critical challenges, such as low specific
growth rates resulting in low chemical productivities and coproduction
of unavoidable by-products, such as 1,2-propanediol. The
reported specific growth rate appears to limit any practical application
since a minimal doubling time of approximately 17 h results
in the consumption of only 8–10 g/L glycerol after 110 h [18,24]. In
addition, glycerol fermentation was successful only when complex
components, such as yeast extract, tryptone, or amino acids which
are required for biomass synthesis, were added to the medium
([18,24]. Fumarate, carnitine, and related C4 dicarboxylates can
be present in tryptone, or generated from some of its components
through degradation of amino acids. These compounds could then
serve as electron acceptors in the respiratory metabolism of glycerol
[18].
The main objective of this study was to develop an engineered
glycerol-utilizing E. coli BL21 (DE3) strain for the production of
bioethanol by overexpressing the ethanol producing gene set of
E. aerogenes KCTC 2190 (Fig. 1). We selected E. coli BL21 (DE3) as a
host strain for the production of bioethanol from glycerol, because
it is very amenable to industrial applications, easy to handle, grows
well, can tolerant up to 3% ethanol, can be easily manipulated
genetically and has never been used for glycerol-derived bioethanol
production in E. coli BL21 (DE3) strain. In this study, five recombinant
E. coli BL21 (DE3) strains were developed by harboring
recombinant plasmids, each containing a different gene set from
the ethanol biosynthetic pathway of E. aerogenes KCTC 2190. The
production of bioethanol in all the recombinant strains was compared
with that in the wild-type counterpart.
2. Materials and methods
2.1. Microorganisms and plasmids
E. coli BL21 (DE3) (genotype: F-ompThsdSB (rB-mB-) gal dcm(DE3)) (Invitrogen
Corporation, Carlsbad, CA, USA) was used for the production of bioethanol, and E. coli
DH5 was used as the host strain. Genomic DNA of E. aerogenes KTCC 2190 was purified
and used as a template to amplify the genes gldA (glycerol dehydrogenase), dhaK
(dihydroxyacetone kinase), pykA (pyruvate kinase), pflB (pyruvate formate-lyase)
and adhE (alcohol dehydrogenase). The plasmids, pETDuet-1 and pACYCDuet-1
(Novagen, Darmstadt, Germany), used for the construction of recombinant plasmids
are listed in Table 1.
2.2. Extraction of genomic DNA
To extract the genomic DNA of E. aerogenes KCTC 2190, overnight culture broth
was transferred to a 1.5-mL microcentrifuge tube and centrifuged at 15,000
×
g for
2 min to pellet the cells. Cell pellets were resuspended in 600 L of lysis buffer
and incubated at 80 ◦C for 5 min to completely lyse the cells. The clear lysed solution
was cooled to room temperature. Then, 3 L of RNase solution was added to
the cell lysate and the tube was inverted 2–5 times to mix well. The sample was
incubated at 37 ◦C for 30 min to digest RNA and cooled to room temperature. The
sample was then mixed with 200 L of protein precipitation solution (PPS). The sample
was vortexed vigorously at a high speed for 20 s and kept on ice for 5 min. The
sample was centrifuged for 3 min, and the supernatant was tran

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

glycolytic เอนไซม์ [17] ขณะเอนไซม์ glycolytic pyruvateไคเนสแปลงหัวเป็น pyruvate ระหว่างเผาผลาญคาร์บอนอื่น ๆแหล่ง (17), ลักษณะเฉพาะของการเผาผลาญของกลีเซอรอลเป็นที่ที่แปลงหัวเป็น pyruvate ควบคู่กับดีเอชเอphosphorylation (เช่น ตั้งแต่ DHAK ใช้หัวเป็นกลุ่มฟอสเฟตผู้บริจาค) ปฏิกิริยาคู่นี้เป็นส่วนประกอบสำคัญของการหมักกลีเซอรอลใน E. coli และสร้างวงจรในการเมแทบอลิซึม(รูปที่ 1) ซึ่งสำหรับวัตถุประสงค์ของแบบจำลองช่วยให้สมมติฐานของกิจกรรมไคเนส pyruvate เล็กน้อย ชีวสังเคราะห์ของ acetyl-CoAจาก pyruvate อาจเกิดขึ้นได้ผ่านสองแตกต่างกันเอนไซม์ pyruvatedehydrogenase ซับซ้อน (PDHC) และ pyruvate formatelyase(PFL) อย่างไรก็ตาม การตรวจสอบพิจารณาอัตราส่วน NADH/NAD สูงระหว่างการหมักกลีเซอรอล [18] และ NADH ที่ส่งควบคุม PDHC [19], PFL คาดว่าจะมีบทบาทหลักการ สุดท้ายประกอบด้วยปฏิกิริยาในทางเดิน biosynthetic ของ bioethanol ใน E. coliแปลง 2 ขั้นตอนของ acetyl-CoA เป็นเอทานอลผ่านการการดำเนินการของ acetaldehyde/แอลกอฮอล์ dehydrogenase (ALDH/อัซ) [19]บางครั้ง มันเป็นความคิดที่การเผาผลาญของกลีเซอรในโคไลต้องการปรากฏตัวของอิเล็กตรอนภายนอก acceptors [20-23],แต่เมื่อเร็ว ๆ นี้ ก็พบว่า E. coli สามารถเผาผลาญกลีเซอรอลในการลักษณะหมัก [16,18,24] นักวิจัยเหล่านี้ยังระบุสภาพแวดล้อมที่ช่วยเผาผลาญอาหารนี้กระบวนการ ทางเดินและกลไกที่รับผิดชอบมัน [16] การศึกษาเหล่านี้ยังแนะนำความเป็นไปได้ของการหมักของกลีเซอรอลเป็นเชื้อเพลิง และอื่น ๆ ลดสารเคมี กระตุ้นให้เกิดการเฉย ๆ พื้นเมือง 1, 2 โพรเพนเดินหมักใน E. coliโดยไม่ต้องใช้ acceptors อิเล็กตรอนภายนอก [18,24] อย่างไรก็ตาม นี้วิธี เผชิญกับความท้าทายสำคัญหลาย เช่นเฉพาะต่ำอัตราการเติบโตลดเคมีต่ำและ coproductionของผลิตภัณฑ์ได้ เช่นโพรเพน 1, 2 การอัตราการเติบโตเฉพาะที่รายงานปรากฏการ จำกัดโปรแกรมปฏิบัติตั้งแต่เวลา doubling น้อยที่สุดประมาณ 17 ชั่วโมงผลลัพธ์ในการใช้เพียง 8 – 10 แยกกลีเซอรหลัง 110 h [18,24] ในนอกจากนี้ การหมักกลีเซอรอลประสบความสำเร็จเมื่อซับซ้อนเท่านั้นส่วนประกอบ เช่นสารสกัดจากยีสต์ tryptone หรือกรดอะมิโนที่จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์ชีวมวล การเพิ่ม([18,24] fumarate คาร์นีทีน และสามารถ dicarboxylates C4 ที่เกี่ยวข้องจะอยู่ใน tryptone หรือสร้างขึ้นจากบางส่วนของคอมโพเนนต์ผ่านการย่อยสลายของกรดอะมิโน สารเหล่านี้อาจแล้วเป็น acceptors อิเล็กตรอนในการเผาผลาญระบบทางเดินหายใจของกลีเซอรอล[18]วัตถุประสงค์หลักของการศึกษานี้คือการ พัฒนาการออกแบบใช้กลีเซอรอล E. coli BL21 (DE3) สายพันธุ์สำหรับการผลิตชุด bioethanol โดย overexpressing เอทานอลผลิตยีนE. aerogenes 2190 KCTC (1 รูป) เราเลือก E. coli BL21 (DE3) ที่มีโฮสต์สำหรับการผลิต bioethanol จากกลีเซอรอล เนื่องจากก็คล้อยตามมากการอุตสาหกรรม ง่ายต่อการจัดการ เติบโตดี สามารถทนต่อค่าเอทานอล 3% สามารถจัดการได้อย่างง่ายดายพันธุกรรม และไม่ใช้สำหรับ bioethanol ได้กลีเซอรอลผลิตใน E. coli BL21 (DE3) สายพันธุ์ ในการศึกษานี้ ควบรวมห้าE. coli BL21 (DE3) สายพันธุ์ต่าง ๆ ที่เก็บงำแต่ละที่ประกอบด้วยยีนต่างกันตั้ง recombinant plasmids จากทางเอทานอ biosynthetic เดินของ E. aerogenes KCTC 2190 การผลิต bioethanol ในทุกสายพันธุ์ recombinant ถูกเปรียบเทียบโดยที่ในคู่ชนิดป่า2. วัสดุและวิธีการ2.1. จุลินทรีย์และ plasmidsE. coli BL21 (DE3) (พันธุ์: F-ompThsdSB (อ.ระพี - mB-) dcm(DE3)) gal (Invitrogenคอร์ปอเรชั่น คาร์ลบาด CA, USA) ใช้สำหรับการผลิต bioethanol, E. coliDH5 ถูกใช้เป็นสายพันธุ์ของโฮสต์ บริสุทธิ์การดีเอ็นเอของ E. aerogenes KTCC 2190และใช้เป็นแม่แบบเพื่อขยาย gldA ยีน (กลีเซอรอล dehydrogenase), dhaK(ไคเนส) dihydroxyacetone, pykA (ไคเนส pyruvate), pflB (pyruvate รูปแบบเอกสาร lyase)และ adhE (แอลกอฮอล์ dehydrogenase) Plasmids, pETDuet-1 และ pACYCDuet-1(Novagen ดาร์มสตัดท์ เยอรมนี), ใช้สำหรับการก่อสร้างของ recombinant plasmidsระบุไว้ในตารางที่ 12.2. การสกัดดีเอ็นเอในจีโนมของการแยกตัวการดีเอ็นเอของ E. aerogenes KCTC 2190 ค้างคืนวัฒนธรรมซุปโอนไปหลอด 1.5 มิลลิลิตรไมโคร และเหวี่ยง 15,000×กรัมสำหรับ2 นาทีกับ pellet เซลล์ เซลล์ขี้ถูก resuspended ใน 600 L lysis บัฟเฟอร์และได้รับการกกที่ 80 ◦C 5 นาทีการ lyse เซลล์อย่างสมบูรณ์ โซลูชัน lysed ชัดเจนความร้อนอุณหภูมิห้อง แล้ว 3 L ของ RNase ถูกเพิ่มลงในเซลล์ lysate ของและหลอดถูกคว่ำ 2-5 ครั้งเพื่อผสมให้เข้ากัน เป็นตัวอย่างได้รับการกกที่ ◦C 37 30 นาทีย่อย RNA และเย็นที่อุณหภูมิห้อง การตัวอย่างได้แล้วผสมกับ L 200 ของโปรตีนฝน (PPS) ตัวอย่างถูก vortexed แรง ๆ ที่ความเร็วสูงสำหรับ 20 s และเก็บไว้บนน้ำแข็งสำหรับ 5 นาทีในตัวอย่างถูกเหวี่ยง 3 นาที และ supernatant เป็นทราน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เอนไซม์ glycolytic [17] ในขณะที่ glycolytic เอนไซม์ไพรู
ไคเนสแปลง PEP เข้าไพรูในระหว่างการเผาผลาญอาหารของคาร์บอนอื่น ๆ
แหล่งที่มา (17) ซึ่งเป็นเอกลักษณ์ของการเผาผลาญกลีเซอรีน
คือการแปลงของ PEP เข้าไพรูจะคู่กับดีเอชเอ
phosphorylation (กล่าวคือตั้งแต่ทองกวาวใช้ PEP เป็นกลุ่มฟอสเฟต
ผู้บริจาค) ปฏิกิริยาคู่นี้เป็นส่วนประกอบที่สำคัญของการหมักกลีเซอรอล
ใน E. coli และสร้างวงจรในเส้นทางการเผาผลาญ
(รูปที่ 1). ซึ่งวัตถุประสงค์ของรูปแบบที่ช่วยให้สมมติฐานของ
กิจกรรมไคเนสไพรูเล็กน้อย สังเคราะห์ acetyl-CoA
จากไพรูสามารถเกิดขึ้นได้ผ่านสองเอนไซม์ที่แตกต่างกันไพรู
dehydrogenase คอมเพล็กซ์ (PDHC) และไพรู formatelyase
(PFL) อย่างไรก็ตามการพิจารณาอัตราส่วน NADH สูง / NAD สังเกต
ระหว่างการหมักกลีเซอรอล [18] และได้รับในเชิงลบที่ NADH
ควบคุม PDHC [19], PFL คาดว่าจะมีบทบาทหลัก สุดท้าย
ปฏิกิริยาในทางเดินชีวสังเคราะห์ของเอทานอลใน E. coli ประกอบด้วย
ของการแปลงแบบสองขั้นตอนของ acetyl-CoA เอทานอลผ่าน
การกระทำของ acetaldehyde / dehydrogenase เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ (ALDH / ADH) [19].
บางครั้งก็คิด ที่เผาผลาญอาหารของกลีเซอรอลใน
อี coli ต้องปรากฏตัวของตัวรับอิเล็กตรอนภายนอก [20-23] ที่
แต่เมื่อเร็ว ๆ นี้ก็พบว่าเชื้อ E. coli สามารถเผาผลาญกลีเซอรอล
ในลักษณะหมัก [16,18,24] นักวิจัยเหล่านี้ยัง
ระบุสภาพแวดล้อมที่ช่วยให้การเผาผลาญนี้
กระบวนการพร้อมกับเซลล์และกลไกความรับผิดชอบสำหรับ
มัน [16] การศึกษาเหล่านี้ยังชี้ให้เห็นความเป็นไปได้ของการหมัก
ของกลีเซอรอลเข้าเชื้อเพลิงและสารเคมีอื่น ๆ ลดลงโดยการกระตุ้นให้เกิด
เฉยๆพื้นเมือง 1,2-โพรเพนเดินหมักใน E. coli
โดยไม่ต้องใช้ตัวรับอิเล็กตรอนภายนอก [18,24] แต่นี้
วิธีการเผชิญกับความท้าทายที่สำคัญหลายประการเช่นต่ำเฉพาะ
อัตราการเจริญเติบโตที่เกิดในผลผลิตทางเคมีต่ำและ coproduction
ของหลีกเลี่ยงไม่ได้โดยผลิตภัณฑ์เช่น 1,2-โพรเพน
รายงานอัตราการเจริญเติบโตที่เฉพาะเจาะจงจะปรากฏขึ้นเพื่อ จำกัด การใช้ในทางปฏิบัติใด ๆ
ตั้งแต่เวลาเพิ่มขึ้นน้อยที่สุดของผลประมาณ 17 ชั่วโมง
ในการบริโภคเพียง 8-10 กรัม / ลิตรกลีเซอรอลหลังจากที่ 110 H [18,24] ใน
นอกจากนี้การหมักกลีเซอรีนที่ประสบความสำเร็จได้ก็ต่อเมื่อมีความซับซ้อน
ส่วนประกอบเช่นกรดสารสกัดจากยีสต์, Tryptone หรืออะมิโนที่
จำเป็นสำหรับการสังเคราะห์สารชีวมวลที่ถูกเพิ่มเข้ากลาง
([18,24]. fumarate, dicarboxylates Carnitine และที่เกี่ยวข้องสามารถ C4
จะอยู่ใน Tryptone หรือสร้างขึ้นจากบางส่วนของส่วนประกอบของ
ผ่านการย่อยสลายของกรดอะมิโน. สารเหล่านี้ก็จะ
ทำหน้าที่เป็นตัวรับอิเล็กตรอนในการเผาผลาญอาหารทางเดินหายใจของกลีเซอรอล
[18].
วัตถุประสงค์หลักของการศึกษาครั้งนี้คือการพัฒนาวิศวกรรม
กลีเซอรอล-ใช้ E. coli BL21 (DE3) สายพันธุ์สำหรับการผลิต
เอทานอลโดย overexpressing ชุดยีนเอทานอลผลิตของ
อี aerogenes KCTC 2190 (รูปที่ 1).. เราเลือก E. coli BL21 (DE3) เป็น
สายพันธุ์ที่เป็นเจ้าภาพในการผลิตเอทานอล จากกลีเซอรอลเพราะ
มันเป็นคล้อยตามมากในการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรม, ง่ายต่อการจัดการเติบโต
ดีสามารถทนได้ถึง 3% เอทานอลสามารถจัดการได้อย่างง่ายดาย
พันธุกรรมและไม่เคยถูกนำมาใช้เอทานอลกลีเซอรอลที่ได้มาจาก
การผลิตใน E. coli BL21 (DE3 ) สายพันธุ์ ในการศึกษานี้ห้า recombinant
อี coli BL21 (DE3) สายพันธุ์ที่ได้รับการพัฒนาโดยเก็บงำ
พลาสมิด recombinant แต่ละที่มียีนที่แตกต่างกันตั้งจาก
ทางเดินเอทานอลสังเคราะห์อี aerogenes KCTC 2190.
การผลิตเอทานอลในทุกสายพันธุ์ recombinant เมื่อเทียบ
กับที่ในป่าประเภทคู่ .
2 วัสดุและวิธีการ
2.1 จุลินทรีย์และพลาสมิด
อี coli BL21 (DE3) (genotype: F-ompThsdSB (RB-mB-) GAL DCM (DE3)) (Invitrogen
คอร์ปอเรชั่น Carlsbad, CA, USA) ถูกนำมาใช้ในการผลิตเอทานอลและ E. coli
DH5? ถูกใช้เป็นสายพันธุ์โฮสต์ ดีเอ็นเอของเชื้อ E. aerogenes KTCC 2190 บริสุทธิ์
และใช้เป็นแม่แบบในการขยายยีน gldA (กลีเซอรอล dehydrogenase) ทองกวาว
(dihydroxyacetone ไคเนส) Pyka (ไพรูไคเนส) pflB (ไพรูรูปแบบ-ไอเลส)
และ Adhe (เครื่องดื่มแอลกอฮอล์ dehydrogenase) . พลาสมิด, pETDuet-1 และ pACYCDuet-1
(Novagen, Darmstadt, เยอรมนี) ใช้สำหรับการก่อสร้างของพลาสมิด recombinant
มีการระบุไว้ในตารางที่ 1
2.2 การสกัดดีเอ็นเอ
ต้องการแยกดีเอ็นเอของเชื้อ E. aerogenes KCTC 2190 น้ำหมักค้างคืน
ถูกย้ายไปยังหลอดไมโคร 1.5 มิลลิลิตรและหมุนเหวี่ยงที่ 15,000
×
กรัมสำหรับ
2 นาทีถึงเม็ดเซลล์ เม็ดมือถือถูก resuspended ใน 600 L ของบัฟเฟอร์สลาย
และบ่มที่ 80 ◦Cเป็นเวลา 5 นาทีจะสมบูรณ์ lyse เซลล์ วิธีการแก้ปัญหาที่ชัดเจน lysed
ถูกระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้อง จากนั้น 3 หรือไม่? L ของการแก้ปัญหา RNase ถูกบันทึกอยู่ใน
lysate เซลล์และหลอดถูกคว่ำ 2-5 ครั้งเพื่อผสมให้เข้ากัน กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการ
บ่มที่ 37 ◦Cเป็นเวลา 30 นาทีในการย่อยอาร์เอ็นเอและระบายความร้อนที่อุณหภูมิห้อง
ตัวอย่างแล้วผสมกับ 200? L ของการแก้ปัญหาการตกตะกอนโปรตีน (PPS) กลุ่มตัวอย่างที่
ได้รับการหมุนวนอย่างแรงที่มีความเร็วสูง 20 และเก็บไว้ในน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที
ตัวอย่างปั่นเป็นเวลา 3 นาทีและสารละลายที่ถูก Tran