CCV-RNA was extracted using the gua

CCV-RNA was extracted using the guanidine method (Cha et al., 1991), denatured at 65°C for 5 min, and then reverse-transcribed into cDNA, in a total volume of 20 μl and at 37°C for 1 h, using 50 units MuLV reverse transcriptase (Perkin Elmer). Ten μl RNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 400 μM dNTP, and 10 units RNAse inhibitor were added to a reaction mixture. CCV RNA was detected by semi-nested RT-PCR using three primers created from the 3’ end of spike gene of CCV strain Insavc-1 (Horsburgh et al., 1992). In the first amplification step, 2 μl cDNA sample were amplified in a 50 μl reaction volume containing 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 200 μM dNTP, 1.5 units Taq DNA polymerase (QIAGEN, Germany) and 15 pM each of outer sense primer; CCV1 (located at position 1691: 5’ GGC GTA ACT GAT GGA CCA CG 3’) and outer anti-sense primer; CCV2 (located at position 2451: 5’ CTT GTA CGG GCG GCA ACA TC 3’). PCR conditions consisted of 94°C for 2 min, followed by 40 cycles

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

CCV-อาร์เอ็นเอที่สกัดโดยวิธี guanidine (ชะอำ et al., 1991), denatured ที่ 65° C สำหรับ 5 นาที และจากนั้น ย้อนกลับทับศัพท์เป็น cDNA ปริมาณรวม ของ 20 μl และ ที่ 37° C สำหรับ 1 h ใช้ 50 หน่วย MuLV กลับ transcriptase (เพอร์เอลเมอ) Μl สิบอาร์เอ็นเอ KCl ตรี-HCl (pH 8), 400 μM dNTP, 10 มม. 50 มม. และ 10 หน่วย RNAse ผลได้เพิ่มส่วนผสมของปฏิกิริยา อาร์เอ็นเอ CCV พบ โดยกึ่งซ้อน RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์สามที่สร้างขึ้นจากปลาย 3' ของยีนชั่วของ CCV ต้องใช้ Insavc-1 (Horsburgh et al., 1992) ในขั้นตอนแรกที่ขยาย ตัวอย่าง 2 μl cDNA ถูกขยายปริมาณปฏิกิริยา 50 μl ประกอบด้วย 50 mM KCl, MgCl2 ตรี-HCl (pH 8), 200 μM dNTP, 10 mM 1.5 mM 1.5 หน่วย Taq DNA พอลิเมอเรส (QIAGEN เยอรมนี) และ 15 pM แต่ละพื้นความรู้สึกภายนอก CCV1 (อยู่ที่ตำแหน่ง 1691:5 'GGC GTA กระทำแกทพ้อยท์ GGA CCA CG 3') และภายนอกความรู้สึกต่อต้านพื้น CCV2 อยู่ตำแหน่ง 2451:5 'CTT GTA CGG GCG GCA ACA TC 3') ประกอบด้วยเงื่อนไข PCR 94° C สำหรับ 2 นาที ตาม ด้วยรอบ 40

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

CCV-RNA ถูกสกัดโดยใช้วิธีการ guanidine (Cha et al., 1991), เอทิลแอลกอฮอล์ที่ 65 ° C เป็นเวลา 5 นาทีและจากนั้นย้อนกลับไปถ่ายยีนในปริมาณรวมของ 20 ไมโครลิตรและที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง โดยใช้ 50 หน่วย MuLV reverse transcriptase (Perkin Elmer) สิบ RNA ไมโครลิตร 50 มิลลิ KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 400 ไมครอน dNTP, และ 10 หน่วยยับยั้ง RNase ถูกเพิ่มเข้าไปผสมปฏิกิริยา CCV RNA ถูกตรวจพบโดยกึ่งซ้อน RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์สามสร้างขึ้นจากปลาย 3 'ของยีนขัดขวางของสายพันธุ์ CCV Insavc-1 (Horsburgh et al., 1992) ในขั้นตอนการขยายแรก 2 ตัวอย่าง cDNA ไมโครลิตรถูกขยายในปริมาณ 50 ไมโครลิตรปฏิกิริยาที่มีขนาด 50 มม KCl, 1.5 มิลลิ MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 200 ไมครอน dNTP 1.5 หน่วย Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (QIAGEN เยอรมนี ) และ 15 นแต่ละไพรเมอร์ความรู้สึกด้านนอก; CCV1 (อยู่ที่ 1,691 อัตรา: 5 'GGC GTA ACT GAT GGA CCA CG 3) และรองพื้นป้องกันความรู้สึกด้านนอก; CCV2 (อยู่ที่ 2,451 อัตรา: 5 'CTT GTA CGG GCG GCA ACA TC 3') เงื่อนไข PCR ประกอบด้วย 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีตามด้วย 40 รอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ccv-rna ถูกสกัดโดยใช้วิธีกัวนิดีน ( ชา et al . , 1991 ) เกิดที่ 65 ° C เป็นเวลา 5 นาที แล้วกลับถ่ายทอดเป็นยีนในปริมาตรรวม 20 μ L และที่ 37 °องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง โดยใช้ 50 หน่วย mulv reverse transcriptase ( เพอร์กินเอลเมอร์ ) 10 μ L RNA KCl 50 มม. หรือ 10 มม. ขาว ( pH 8 ) , 400 μ M dntp และ 10 หน่วยเลสถูกยับยั้งปฏิกิริยาผสมCCV อาร์เอ็นเอที่ถูกตรวจพบโดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์กึ่งซ้อนกันสามสร้างขึ้นจากปลาย 3 ' ของยีน CCV ขัดขวาง insavc-1 สายพันธุ์ ( horsburgh et al . , 1992 ) ในขั้นตอนแรก ( 2 μ L ยีนจำนวนขยายใน 50 μ l ปริมาณที่มีอัตราการเกิดปฏิกิริยา 50 มม. 1.5 มม. หรือ 10 มม. ชุด HCL , ( pH 8 ) , 200 μ M dntp 1.5 หน่วยดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ( เร็งได้ดี ,เยอรมนี ) และ 15 น. แต่ละคู่นึกนอก ; ccv1 ( ตั้งอยู่ที่ตำแหน่ง 1636 : 5 ' ggc GTA ทำ GAT ก๊ะ CCA CG 3 ' ) และภายนอกต่อต้านความรู้สึกไพรเมอร์ ccv2 ( ตั้งอยู่ที่ตำแหน่ง 1701 : 5 ' ซีทีที GTA CGG gcg GCA ACA TC 3 ' ) เงื่อนไขซึ่งประกอบด้วย 94 ° C เป็นเวลา 2 นาที ตามด้วย 40 รอบ