plasmidwas constructed by cloning t

plasmid
was constructed by cloning the dhaK, pykA and gldA genes one by one into
the pETDuet-1expression plasmid using BamHI/EcoRI, EcoRI/SacI, and SacI/HindIII
restriction enzymes, respectively (Fig. 2A–C). The cloning of all three genes in one
operon was confirmed by restriction enzyme digestion of the recombinant plasmid
pETLT by the respective enzymes (Fig. 3).
Similarly, the recombinant plasmid pACYE was constructed by cloning the adhE
gene into the pACYDuet-1 plasmid using EcoRI/SacI restriction enzymes, and the
recombinant plasmid pACYEB was constructed by cloning the pflB gene into the
recombinant plasmid pACYE using SacI/HindIII restriction enzymes; (Fig. 2D–E).
The construction of each recombinant plasmid was confirmed using agarose gel
electrophoresis (Fig. 3). Plasmids were introduced into E. coli BL21 (DE3) by transformation
using the calcium chloride procedure as described by Mandel and Higa
[25]. The transformants were screened on a LB agar plate containing the appropriate
antibiotics. The plasmid DNA of all transformants was made and transformation
was confirmed by restriction enzyme digestion. The recombinant strain harboring
pETDuet-1 plasmid was referred to as pET, pETDK recombinant plasmid was referred
to as pK, pETDKA recombinant plasmid was referred to as pKA, pETLT recombinant
plasmid was referred to as pKAA, pACYEB recombinant plasmid was referred to as
pEB, and pACYE recombinant plasmid was referred to as pE.
2.4. Culture conditions
Wild-type E. coli BL21(DE3) and E. coli DH5 were grown in Luria-Bertani
(LB) medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, and 5 g/L NaCl). Seed cultures
Fig. 4. Bioethanol produced by various recombinant strains of E. coli; E. coli BL21
(DE3), pET; expressing the pETDuet-1 plasmid; pETDK; expressing dhaK, and pETDKA;
expressing pykA along with dhaK, pETLT; expressing gldA along with dhaK and
pykA, pACYE; expressing adhE and pACYEB; expressing pflB along with adhE.
of recombinant strains were performed in LB medium containing 50 g/mL ampicillin
and 25 g/mL chloramphenicol for 16 h at 34 ◦C and 150 rpm. Two milliliters
of seed culture was transferred to a 250-mL elementary flask containing 100 mL
production medium (10 g/L glycerol, 40 g/L (NH4) SO4, 1.5 g/L MgCl2, 3.5 g/L KH2PO4,
3.5 g/L K2HPO4, 0.002 g/L FeSO4, 0.002 g/L MnSO4, 0.05 g/L CaCl2, 0.01 g/L ZnSO4, and
3 g/L tryptone) and incubated for 48 h at 34 ◦C and 150 rpm.
Fig

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

พลาสมิด
ถูกสร้างขึ้นจากโคลนทองกวาว, Pyka และยีน gldA หนึ่งโดยหนึ่งเข้าไปใน
พลาสมิด pETDuet-1expression ใช้ BamHI / EcoRI, EcoRI / SACI และ SACI / HindIII
เอนไซม์ข้อ จำกัด ตามลำดับ (รูป. 2A-C) โคลนของทั้งสามยีนในหนึ่ง
operon รับการยืนยันโดยการย่อยอาหารเอนไซม์ จำกัด ของพลาสมิด recombinant
pETLT โดยเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง (รูปที่. 3).
ในทำนองเดียวกัน recombinant พลาสมิด pACYE ถูกสร้างขึ้นจากโคลน Adhe
ยีนเข้าไปใน pACYDuet-1 พลาสมิดใช้ EcoRI / SACI จำกัด เอนไซม์และ
pACYEB พลาสมิด recombinant ถูกสร้างขึ้นโดยการโคลนยีน pflB เข้าไปใน
pACYE พลาสมิด recombinant ใช้ SACI / เอนไซม์ข้อ จำกัด HindIII; (รูป. 2D-E).
การก่อสร้างของแต่ละพลาสมิด recombinant ได้รับการยืนยันโดยใช้เจล agarose
electrophoresis (รูปที่. 3) พลาสมิดที่ถูกนำเข้าสู่ E. coli BL21 (DE3) โดยการเปลี่ยนแปลง
โดยใช้ขั้นตอนแคลเซียมคลอไรด์ตามที่อธิบาย Mandel และ Higa
[25] transformants ถูกฉายบนแผ่นวุ้น LB ที่มีความเหมาะสม
ยาปฏิชีวนะ พลาสมิดดีเอ็นเอของ transformants ทั้งหมดถูกสร้างขึ้นมาและการเปลี่ยนแปลง
รับการยืนยันจากข้อ จำกัด ของเอนไซม์ย่อยอาหาร สายพันธุ์ recombinant เก็บงำ
pETDuet-1 พลาสมิดก็จะเรียกว่าสัตว์เลี้ยง pETDK พลาสมิด recombinant ถูกเรียก
ว่าเภสัชจลนศาสตร์ pETDKA พลาสมิด recombinant ก็จะเรียกว่า PKA, pETLT recombinant
พลาสมิดก็จะเรียกว่า pKAA, pACYEB พลาสมิด recombinant ก็จะเรียกว่า
PEB, และพลาสมิด pACYE recombinant ก็จะเรียกว่า PE.
2.4 เงื่อนไขวัฒนธรรม
ป่าชนิดเชื้อ E. coli BL21 (DE3) และ E. coli DH5? ถูกปลูกใน Luria-Bertani
(ปอนด์) ขนาดกลาง (10 กรัม / ลิตร Tryptone 5 g / L สารสกัดจากยีสต์และ 5 กรัม / ลิตรโซเดียมคลอไรด์) วัฒนธรรมเมล็ดพันธุ์
มะเดื่อ 4. เอทานอลที่ผลิตโดยสายพันธุ์ต่างๆของ recombinant E. coli; E. coli BL21
(DE3), PET; แสดงความ pETDuet-1 พลาสมิด; pETDK; แสดงทองกวาวและ pETDKA;
แสดง Pyka พร้อมกับทองกวาว, pETLT; แสดง gldA พร้อมกับทองกวาวและ
Pyka, pACYE; แสดง Adhe และ pACYEB; แสดง pflB พร้อมกับ Adhe.
สายพันธุ์ recombinant ได้ดำเนินการในระดับปานกลางที่มี LB 50 กรัม / มิลลิลิตร ampicillin
และ 25? g / ml chloramphenicol 16 ชั่วโมงที่ 34 ◦Cและ 150 รอบต่อนาที สองมิลลิลิตร
ของวัฒนธรรมเมล็ดถูกย้ายไปขวดประถม 250 มิลลิลิตรที่มี 100 มล
กลางการผลิต (10 กรัม / ลิตรกลีเซอรีน 40 กรัม / ลิตร (NH4) SO4 1.5 กรัม / ลิตร MgCl2 3.5 กรัม / ลิตร KH2PO4,
3.5 กรัม / L K2HPO4 0.002 กรัม / ลิตร FeSO4, 0.002 กรัม / ลิตร MnSO4, 0.05 กรัม / ลิตร CaCl2 0.01 กรัม / ลิตร ZnSO4 และ
3 กรัม / ลิตร Tryptone) และบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมง 34 ◦Cและ 150 รอบต่อนาที.
รูป

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

质粒被克隆的塔格构造Pyka，GLDA逐一为基因用BamHI酶的petduet-1expression质粒，经EcoRI / SacI位，和SacI和HindIII限制酶，分别为（图2A–C）。三个基因的克隆操纵子的重组质粒经酶切证实由各自的酶petlt（图3）。同样，重组质粒的构建pacye克隆均基因利用限制酶EcoRI / SacI pacyduet-1质粒，和重组质粒pacyeb被克隆到了pflB基因重组质粒pacye用SacI和HindIII酶；（图2D–E）。用琼脂糖凝胶电泳对重组质粒的构建进行了验证电泳（图3）。质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）的转化用氯化钙法是由曼德尔和比嘉描述[ 25 ]。转化在含有适当的LB琼脂平板筛选抗生素。所有的转化的质粒DNA进行了改造经酶切证实。重组菌株petduet-1质粒称为宠物，petdk重组质粒称为PK，petdka重组质粒简称PKA，petlt重组质粒被称为pkaa，pacyeb重组质粒称为PEB，和pacye重组质粒简称PE。2.4。培养条件野生型大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌DH5在Luria-Bertani生长（LB）中（10 g/L胰蛋白胨、酵母膏5 g/L，5 g/L NaCl）。种子培养图4。由大肠杆菌产生的各种重组大肠杆菌BL21菌株生物乙醇；（DE3），PET；表达petduet-1质粒；petdk；表达塔格，和petdka；表达随着塔格，Pyka petlt；表达随着塔格GLDA和Pyka，pacye；表达粘附和pacyeb；表达随着杆菌pflB。重组菌株在LB培养基含50μg/ml氨苄青霉素25克/ 34毫升◦C和150转16 h氯霉素。两毫升种子培养被转移到一个250毫升的基本瓶含有100毫升生产中（10 g/L甘油40 g / L的（NH4）SO4、1.5 g/L氯化镁，3.5 g／L磷酸二氢钾，3.5 g/L，K2HPO4，FeSO4 0.002 g/L，0.002 g/L硫酸锰，0.05 g/L氯化钙，0.01 g/L硫酸锌，和3 g/L胰蛋白胨）孵育48 h在34◦C和150转。图